Использование тест-систем «Амплисенс HCV-1/2/3» c детекцией продуктов ПЦР в реальном времени для выявления и генотипирования РНК HCV в рутинной лабораторной практике
Важным прогностическим маркером эффективности противовирусной терапии при инфекции вирусом гепатита С ( HCV) является его генотип. Генотип HCV определяет дозу препарата и продолжительность курса лечения, что актуально, учитывая широкий спектр побочных действий и низкую переносимость интерферона в процессе терапии. Выделяют шесть генотипов вируса (1-6). Для генотипа 1 характерен крайне низкий ответ на проводимую терапию. Факторами, обусловливающими эффективность лечения, являются генотипы 2 или 3, низкая вирусная нагрузка и незначительные гистологические изменения при биопсии печени. Для практического врача, принимающего решение о назначении этиотропной терапии, результат теста, определяющего генотип вируса, не менее важен, чем определение репликативной активности HCV и вирусной нагрузки.
В настоящее время используются методики и коммерческие тест-системы на основе полимеразной цепной реакции для определения как генотипов, так и субтипов HCV . Методики, предназначенные для субтипирования как правило сложны, трудоемки, дороги и используются только для решения эпидемиологических задач. В рутинной лабораторной практике используются методики для определения только генотипов HCV , причем, спектр выявляемых генотипов часто ограничен несколькими из них, встречающимися на данной территории. Поскольку для территории России характерна циркуляция HCV генотипов 1, 2 и 3, генотип 4 представлен единичными завозными случаями, а генотипы 5 и 6 не выявлены, такой подход позволяет снизить экономические затраты на решение актуальной клинической задачи.
В Центре Молекулярной Диагностики (ЦМД) при ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора в течение длительного времени для выявления РНК HCV и определения генотипа HCV использовались ПЦР-тесты с использованием метода экстракции РНК на частицах силикагеля (РИБО-сорб) и электрофоретической детекцией продуктов амплификации – «АмплиСенс HCV» и «АмплиСенс HCV -генотипы». Аналитическая чувствительность тест-системы для выявления РНК HCV составляет 10 3 ME /мл плазмы, аналитическая чувствительность тест-системы для генотипирования, которая выполняется в формате «мультиплекс» не превышает 10 4 ME /мл плазмы, тест-система позволяет выявлять и дифференцировать 1 a , 1 b, 2, 3a генотипы HCV . Удобство совместного применения этих двух тестов заключается в том, что сначала выполняется тест на качественное определение РНК HCV , в процессе которого с помощью случайных гексануклеотидов получают тотальную кДНК, содержащую продукты обратной транскрипции всех РНК. Полученная при проведении анализа кДНК затем используется в тесте для определения генотипа HCV . Случаи отрицательного результата теста для определения генотипа при положительном результате теста для выявления HCV часто связаны с низкой вирусной нагрузкой (менее 10 4 ME /мл), существенно реже – с присутствием в образце редкого генотипа (например, 4 генотипа HCV ). В случае небольшой разницы в чувствительности тестов, доля нетипируемых образцов будет небольшой, но при увеличении чувствительности теста для выявления РНК HCV , доля нетипируемых образцов будет неизбежно увеличиваться.
Согласно требованиям международного консенсуса, тест-системы для выявления РНК HCV должны обладать высокой чувствительностью, порядка 50 МЕ/мл, поэтому с недавнего времени для выявления РНК HCV в практических лабораториях стала использоваться тест-система с детекцией продуктов амплификации в режиме «реального времени» «АмплиСенс HCV-FRT », чувствительность которой составляет не ниже 100 ME /мл. Поскольку, с увеличением аналитической чувствительности тест-системы, доля РНК HCV -положительных образцов, которые содержат вирус в низкой концентрации (менее 10 4 ME /мл) увеличилась, то, соответственно, увеличился и процент нетипируемых образцов при использовании тест-системы для генотипирования в формате с электрофоретической детекцией продуктов амплификации. Для решения этой проблемы мы использовали новую недавно разработанную тест-систему «АмплиСенс HCV-1/2/3». Тест-система «АмплиСенс HCV -1/2/3» разрабатывалась для определения в HCV -положительных пробах наиболее распространенных на территории России генотипов HCV (1-3), с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени; аналитическая чувствительность тест-системы «АмплиСенс HCV -1/2/3» – 500 МЕ/мл.
Адапация тест-системы «АмплиСенс HCV -1/2/3» для использования в практической лаборатории. Анилиз результатов генотипирования, определение доли и структуры нетипируемых образцов. Сопоставление результатов, полученных с помощью тест-системы «АмплиСенс HCV -1/2/3» с результатами, полученными при использовании тест-системы «АмплиСенс HCV-генотип».
Материалы и методы
Материалом для сравнительной апробации тестов являлись образцы плазмы периферической крови от пациентов, поступающие в лабораторию ЦМД. Образцы были тестированы на наличие РНК HCVc использованием комплекта реагентов «РИБО-преп» для экстракции РНК и комплекта реагентов для проведения ОТ-ПЦР с детекцией продуктов в режиме реального времени «АмплиСенс HCVFRT », вариант 100 с использованием двухканальных приборов « RotorGene3000» (CorbettResearch , Австралия) в формате ротора на 72 пробирки. Всего было протестировано 753 образца, 250 из этих образцов также были протестированы в тест-системе «АмплиСенс HCV-Монитор FRT » с целью определения вирусной нагрузки. Все 753 образца выделенной РНК были протестированы с помощью теста «АмплиСенс HCV-1/2/3» для определения генотипа HCV , а 85 из этих образцов плазмы были параллельно протестированы с помощью теста «АмплиСенс HCV -генотип». Образцы, в которых генотип HCV не определялся при первичном тестировании, были протестированы повторно, с использованием двух методов экстракции РНК – «РИБО-сорб» и «РИБО-преп», с целью сравнения эффективности методик. Образцы, в которых генотип воспроизводимо не определялся, были проанализированы с помощью секвенирования. Для тестирования использовали кДНК, полученную в реакции обратной транскрипции. На первом этапе анализа амплифицировали участок кДНК с использованием специфических праймеров, позволяющх амплифицировать 5’-нетранслируемую область и часть С ore -области (длина фрагмента
670 п.о.), затем определяли последовательность амплифицированного участка. При секвенировании использованы реактивы и оборудование фирмы Applied Biosystems (США), согласно инструкции производителя. Следует отметить, что методика позволяет определить последовательность кДНК HCV в случае достаточного количества ампликона, а значит, достаточного количества исходной РНК HCV . По нашим данным, концентрация РНК в плазме клинических образцов должна быть не ниже 10 5 МЕ/мл.
Из 753 образцов, протестированных на наличие РНК HCV62 оказались негативными, из 691 HCV -положительных образцов в десяти образцах концентрация РНК HCV была меньше 500 МЕ/мл. При определении генотипа HCV с помощью тест-системы «АмплиСенс HCV -1/2/3» 62 негативных образца также оказались негативными, из десяти HCV -положительных образцов с низкой вирусной нагрузкой (менее 500 МЕ/мл, группа А), в четырех генотип определился. Из оставшихся 681 образца, девять образцов показали недостоверный результат (1,3%, группа Б), т.е. значения пороговых циклов ( Ct ) для флуоресцентного сигнала внутреннего контроля в них было больше допустимого (>35.0), следовательно, вследствие низкой эффективности экстракции РНК в этих образцах, чувствительность ее выявления была значительно ниже допустимого предела. В 348 (51,8%) образцах определился генотип 1, в 59-ти (8,8%) - определился генотип 2, в 262 (39,0%) - определился генотип 3. Только в восьми образцах (группа В) генотип не определился при первом тестировании, что составило 1,2%, при этом концентрация РНК HCV в них была достаточно высокой, не менее 1000 МЕ/мл. 18 образцов из группы А и группы Б были тестированы повторно, начиная с этапа экстракции РНК, причем экстракцию РНК проводили параллельно с помощью комлектов реагентов «РИБО-сорб» и «РИБО-преп». Генотип в повторном тестировании определяли с помощью тест-системы «АмплиСенс HCV -1/2/3». Результаты тестирования показали, что метод экстракции РНК не влияет на чувствительность выявления и определения генотипа HCV – получено полное совпадение положительных и отрицательных результатов. Генотип не определялся во всех образцах с концентрацией РНК HCV менее 500 МЕ/мл и в одном образце с концентрацией 970 МЕ/мл. Все образцы из группы В были тестированы повторно. В таблице 1 представлены значения концентраций РНК HCV и результаты повторного тестирования с помощью тест-системы «АмплиСенс HCV-1/2/3» или секвенирования.
Таблица 1. Результаты повторного тестирования образцов, которые при первичном тестировании на генотип HCVбыли негативны.